PROTOCOL

PCR

  1. Utilitzar 25 μl de DNA de la mostra per treballar la reacció de PCR.
  2. Preparar un control negatiu d’amplificació; col·locar 2,5 μl d’aigua lliure de nucleases en lloc del DNA, que ens serveix per comprovar si els reactius, micropipetes i puntes estan o no contaminats amb DNA.
  3. Preparar un control positiu d’amplificació, per a això col·locar 2,5 μl del control positiu Rh+ en lloc del DNA.

4. Barrejem bé, el colorant vermell inclòs a la polimerasa facilita el procés.

5. Per a aquells termocicladors que no tinguin un “heated lid”, afegir 25 μl de oli mineral per prevenir evaporació.

6. Realitzar el procés damplificació. Per a l’activació de la Polimerasa “HOT STAR” és necessari programar un pas de desnaturalització inicial de 10 minuts a 95ºC, després programar els 30 o 40 cicles específics de cada producte a amplificar.

7. El producte de la PCR pot ser sembrat directament en un gel d’agarosa després de la PCR, ja que el colorant vermell actua com a tampó de càrrega.

8. Utilitzar el mètode de detecció o tinció de l’ADN que es faci servir al laboratori. Utilitzem el  GELSAFE.