PROTOCOL D’EXTRACCIÓ

1. Tenir en compte el pretractament de la mostra.

Es recomana no menjar res durant els 30 minuts previs a la presa de mostra.

Passar la llengua amb moviments dalt-baix per les parets de les galtes, mandíbules i paladar per recollir les cèl.lules.

2. Dipositem en un recipient de recollida de saliva, 1,5 mL.

3. D’aquests 1,5 mL, agafem 600-800 μl, amb una micropipeta, de saliva per posar-ho a un tup eppendorf.

4. Centrifugar durant 90 segons a 13.000-16.000 x g en una centrifuga d’alta velocitat.

5. Eliminar el sobrenadant amb una pipeta pasteur sense tocar el pellet de cèl.lules del fons.

6. Afegim 600  μl de tampó de Lisis al tub eppendorf amb el pellet que hem deixat al fons.

7. Amb la mateixa micropipeta fem moviments de dalt a baix per dissoldre el pellet de cèl.lules i lisar-lo fins que no s’observe cap grumoll blanc.

8. Incubar 10 minuts. Agitar el tub suaument cada 2 minuts. Si és possible incubar a 37ºC.

9. Afegim 200  μl de tampó de Precipitació de proteines al lisat de cèl.lules.

10. Mesclar vigorosament amb agitador tipo vòrtex durant 20-30 segons.

11. Centrifuguem a 13.000-16.000 x g durant 5 minuts. És formarà un precipitat, però si observem que hi han partícules flotant és torna a centrifugar.

12. Traspassem el sobrenedant a un microtub de 1,5 mL eppendorf, que contingui 600 μl d’Isopropanol.

13. Mesclem per inversió 25-50 vegades.

14. Centrifuguem 13.000-16.000 x g durant 2 minuts. L’ADN serà visible com un pellet blanc.

15. Eliminem el sobrenedant i assequem el tub en paper absorbent.

16. Afegim 600  μl d’Etanol 70% per rentar l’ADN.

17. Centrifugar a 13.000-16.000 x g durant 1 minut. Eliminem el sobrenedant sense tocar el pellet d’ADN.

18. Tornem a centrifugar i amb una micropipeta fina recollim l’etanol residual.

19. Invertim el microtub en un paper absorbent i deixem assecar durant 5-10 minuts.

20. Afegim 100-750  μl de tampó d’hidratació, depenent del tamany del pellet d’ADN. Per a pellets molt petits podem utilitzar 25-50  μl de tampó d’hidratació.

21. Conservar a 2-8ºC. Per emmagatzematge llarg conservar a -20ºC o -80ºC.

22. Nosaltres, a més a més d’una mostra per a l’electroforesis, caldrà guardar al congelador una altra mostra amb 100  μl per a la pràctica de PCR.